വൈറസ് ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് കണ്ടെത്തൽ

മിക്ക വൈറസുകളുടെയും ജീനോമിക് സീക്വൻസുകൾ അറിയപ്പെടുന്നു.പൂരക വൈറൽ ഡിഎൻഎ അല്ലെങ്കിൽ ആർഎൻഎ വിഭാഗങ്ങളുമായി സങ്കരമാക്കാൻ രൂപകൽപ്പന ചെയ്തിട്ടുള്ള ഡിഎൻഎയുടെ ചെറിയ ഭാഗങ്ങളായ ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് പ്രോബുകൾ.പോളിമറേസ് ചെയിൻ റിയാക്ഷൻ (പിസിആർ) വൈറൽ കണ്ടെത്തലിനുള്ള കൂടുതൽ കാര്യക്ഷമമായ സാങ്കേതികതയാണ്.ഉയർന്ന ത്രൂപുട്ട് ഡയഗ്നോസ്റ്റിക് രീതികൾ അടുത്തിടെ വികസിപ്പിച്ചെടുത്തിട്ടുണ്ട്.

എ. ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് ഹൈബ്രിഡൈസേഷൻ ടെക്നിക്

ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് ഹൈബ്രിഡൈസേഷൻ, പ്രധാനമായും സതേൺ ബ്ലോട്ടിംഗ് (സതേൺ), നോർത്തേൺ ബ്ലോട്ടിംഗ് (വടക്കൻ) എന്നിവയുൾപ്പെടെ, വൈറസ് ഡയഗ്നോസ്റ്റിക് ഫീൽഡിൽ അതിവേഗം വികസിച്ചുകൊണ്ടിരിക്കുന്ന ഒരു പുതിയ സാങ്കേതികതയാണ്.കോംപ്ലിമെന്ററി വൈറൽ ഡിഎൻഎ അല്ലെങ്കിൽ ആർഎൻഎ സെഗ്‌മെന്റുകൾ ഉപയോഗിച്ച് ഹൈബ്രിഡൈസ് ചെയ്യാൻ രൂപകൽപ്പന ചെയ്‌തിരിക്കുന്ന ഡിഎൻഎയുടെ ("പ്രോബ്" എന്ന് വിളിക്കപ്പെടുന്ന) ഹ്രസ്വ ഭാഗങ്ങൾ ഉപയോഗിക്കുന്നതാണ് ഹൈബ്രിഡൈസേഷൻ അസ്സേയുടെ യുക്തി.ചൂടാക്കൽ അല്ലെങ്കിൽ ആൽക്കലൈൻ ചികിത്സ വഴി, ഡബിൾ സ്ട്രാൻഡഡ് ടാർഗെറ്റ് ഡിഎൻഎ അല്ലെങ്കിൽ ആർഎൻഎ ഒറ്റ സ്ട്രോണ്ടുകളായി വേർതിരിക്കപ്പെടുകയും പിന്നീട് ഒരു സോളിഡ് സപ്പോർട്ടിൽ നിശ്ചലമാക്കുകയും ചെയ്യുന്നു.അതിനുശേഷം, ടാർഗെറ്റ് ഡിഎൻഎ അല്ലെങ്കിൽ ആർഎൻഎയുമായി പ്രോബ് കൂട്ടിച്ചേർക്കുകയും ഹൈബ്രിഡൈസ് ചെയ്യുകയും ചെയ്യുന്നു.പ്രോബ് ഐസോടോപ്പ് അല്ലെങ്കിൽ നോൺ-റേഡിയോ ആക്ടീവ് ന്യൂക്ലൈഡ് ഉപയോഗിച്ച് ലേബൽ ചെയ്തിരിക്കുന്നതിനാൽ, ടാർഗെറ്റ് ഡിഎൻഎ അല്ലെങ്കിൽ ആർഎൻഎ ഓട്ടോറേഡിയോഗ്രാഫി വഴിയോ ബയോട്ടിൻ-അവിഡിൻ സിസ്റ്റം വഴിയോ കണ്ടെത്താനാകും.മിക്ക വൈറൽ ജീനോമുകളും ക്ലോണുചെയ്‌ത് ക്രമീകരിച്ചിരിക്കുന്നതിനാൽ, വൈറസ്-നിർദ്ദിഷ്‌ട ശ്രേണികൾ മാതൃകയിലെ പ്രോബുകളായി ഉപയോഗിച്ച് അവ കണ്ടെത്താനാകും.നിലവിൽ, ഹൈബ്രിഡൈസേഷൻ രീതികളിൽ ഉൾപ്പെടുന്നു: ഡോട്ട് ബ്ലോട്ട്, കോശങ്ങളിലെ സിറ്റു ഹൈബ്രിഡൈസേഷൻ, ഡിഎൻഎ ബ്ലോട്ടിംഗ് (ഡിഎൻഎ) (സതേൺ ബ്ലോട്ട്), ആർഎൻഎ ബ്ലോട്ടിംഗ് (ആർഎൻഎ) (നോർത്തേൺ ബ്ലോട്ട്).

B.PCR ടെക്നോളജി

അടുത്ത കാലത്തായി, പിസിആർ അടിസ്ഥാനമാക്കി ഇൻ വിട്രോ ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ടെക്നിക്കുകളുടെ ഒരു പരമ്പര വികസിപ്പിച്ചെടുത്തിട്ടുണ്ട്.ഇൻ വിട്രോ പോളിമറേസ് പ്രതിപ്രവർത്തനം വഴി നിർദ്ദിഷ്ട ഡിഎൻഎ ക്രമം സമന്വയിപ്പിക്കാൻ കഴിയുന്ന ഒരു രീതിയാണ് പിസിആർ.PCR-ന്റെ പ്രക്രിയയിൽ മൂന്ന് ഘട്ടങ്ങളുള്ള ഒരു താപ ചക്രം ഉൾപ്പെടുന്നു: ഡീനാറ്ററേഷൻ, അനീലിംഗ്, എക്സ്റ്റൻഷൻ ഉയർന്ന താപനിലയിൽ (93℃~95℃), ഇരട്ട-ധാരയുള്ള ഡിഎൻഎ രണ്ട് ഒറ്റ ഡിഎൻഎ സ്ട്രോണ്ടുകളായി വേർതിരിക്കപ്പെടുന്നു;പിന്നീട് താഴ്ന്ന ഊഷ്മാവിൽ (37℃~60℃), രണ്ട് സിന്തസൈസ് ചെയ്ത ന്യൂക്ലിയോടൈഡ് പ്രൈമറുകൾ പൂരക ഡിഎൻഎ സെഗ്മെന്റുകളിലേക്ക് അനൽ ചെയ്യുന്നു;ടാക് എൻസൈമിന് (72℃) അനുയോജ്യമായ താപനിലയിൽ, പുതിയ ഡിഎൻഎ ശൃംഖലകളുടെ സമന്വയം പ്രൈമർ 3' അവസാനം മുതൽ കോംപ്ലിമെന്ററി ഡിഎൻഎ ഫലകങ്ങളായും സിംഗിൾ ന്യൂക്ലിയോടൈഡുകൾ മെറ്റീരിയലായും ഉപയോഗിച്ച് ആരംഭിക്കുന്നു.അതിനാൽ ഓരോ സൈക്കിളിനു ശേഷവും ഒരു ഡിഎൻഎ ശൃംഖലയെ രണ്ട് ചങ്ങലകളായി വർധിപ്പിക്കാം.ഈ പ്രക്രിയ ആവർത്തിക്കുന്നതിലൂടെ, ഒരു സൈക്കിളിൽ സമന്വയിപ്പിച്ച ഓരോ DNA ശൃംഖലയും അടുത്ത സൈക്കിളിൽ ടെംപ്ലേറ്റായി ഉപയോഗിക്കാം, കൂടാതെ ഓരോ സൈക്കിളിലും DNA ശൃംഖലകളുടെ എണ്ണം ഇരട്ടിയാക്കുന്നു, അതായത് PCR-ന്റെ ഉത്പാദനം 2n ലോഗ് സ്പീഡിൽ വർദ്ധിപ്പിക്കും.25 മുതൽ 30 വരെ സൈക്കിളുകൾക്ക് ശേഷം, ഇലക്ട്രോഫോറെസിസ് വഴി പിസിആറിന്റെ ഉത്പാദനം തിരിച്ചറിയുന്നു, കൂടാതെ പ്രത്യേക ഡിഎൻഎ ഉൽപ്പന്നങ്ങൾ യുവി ലൈറ്റിന് കീഴിൽ (254nm) നിരീക്ഷിക്കാൻ കഴിയും.സ്പെസിഫിറ്റി, സെൻസിറ്റിവിറ്റി, സൗകര്യം എന്നിവയുടെ പ്രയോജനത്തിനായി, എച്ച്സിവി, എച്ച്ഐവി, സിഎംവി, എച്ച്പിവി തുടങ്ങിയ നിരവധി വൈറൽ അണുബാധകളുടെ ക്ലിനിക്കൽ രോഗനിർണയത്തിൽ പിസിആർ സ്വീകരിച്ചിട്ടുണ്ട്.പിസിആർ വളരെ സെൻസിറ്റീവ് ആയതിനാൽ, ഇതിന് എഫ്ജി തലത്തിൽ വൈറസ് ഡിഎൻഎ കണ്ടെത്താനാകും, തെറ്റായ പോസിറ്റീവ് ഒഴിവാക്കാൻ ഓപ്പറേഷൻ വളരെ ശ്രദ്ധാപൂർവ്വം നടത്തണം.കൂടാതെ, ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് പരിശോധനയിലെ പോസിറ്റീവ് ഫലം സാമ്പിളിൽ തത്സമയ പകർച്ചവ്യാധി ഉണ്ടെന്ന് അർത്ഥമാക്കുന്നില്ല.

പിസിആർ ടെക്നിക്കിന്റെ വിപുലമായ പ്രയോഗത്തിലൂടെ, വ്യത്യസ്ത പരീക്ഷണ ആവശ്യങ്ങൾക്കായി പിസിആർ സാങ്കേതികതയെ അടിസ്ഥാനമാക്കി പുതിയ സാങ്കേതിക വിദ്യകളും രീതികളും വികസിപ്പിച്ചെടുക്കുന്നു.ഉദാഹരണത്തിന്, തത്സമയ ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് PCR-ന് വൈറൽ ലോഡ് കണ്ടെത്താനാകും;ടിഷ്യൂകളിലോ കോശങ്ങളിലോ വൈറസ് അണുബാധ തിരിച്ചറിയാൻ ഇൻ സിറ്റു പിസിആർ ഉപയോഗിക്കുന്നു;നെസ്റ്റഡ് PCR-ന് PCR-ന്റെ പ്രത്യേകത വർദ്ധിപ്പിക്കാൻ കഴിയും.അവയിൽ, തൽസമയ ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് പിസിആർ കൂടുതൽ വേഗത്തിൽ വികസിപ്പിച്ചെടുത്തിട്ടുണ്ട്.ടാക്മാൻ ഹൈഡ്രോളിസിസ് പ്രോബ്, ഹൈബ്രിഡൈസേഷൻ പ്രോബ്, മോളിക്യുലാർ ബീക്കൺ പ്രോബ് തുടങ്ങി നിരവധി പുതിയ സാങ്കേതിക വിദ്യകൾ തത്സമയ ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് പിസിആർ ടെക്നിക്കിലേക്ക് സംയോജിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു, ഇത് ക്ലിനിക്കൽ ഗവേഷണത്തിൽ വ്യാപകമായി ഉപയോഗിക്കുന്നു.രോഗികളുടെ ശരീരദ്രവത്തിലെ വൈറൽ ലോഡ് കൃത്യമായി തിരിച്ചറിയുന്നതിനു പുറമേ, മയക്കുമരുന്ന്-സഹിഷ്ണുതയുള്ള മ്യൂട്ടന്റ് കണ്ടെത്താനും ഈ രീതി ഉപയോഗിക്കാം.അതിനാൽ, തത്സമയ ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് പിസിആർ പ്രധാനമായും ക്യൂറേറ്റീവ് ഇഫക്റ്റ് മൂല്യനിർണ്ണയത്തിലും മയക്കുമരുന്ന് സഹിഷ്ണുത നിരീക്ഷണത്തിലും പ്രയോഗിക്കുന്നു.

C. വൈറൽ ന്യൂക്ലിക് ആസിഡുകളുടെ ഹൈ-ത്രൂപുട്ട് കണ്ടെത്തൽ

ഉയർന്നുവരുന്ന പുതിയ സാംക്രമിക രോഗങ്ങളുടെ വേഗത്തിലുള്ള രോഗനിർണ്ണയത്തിനുള്ള ആവശ്യങ്ങൾ നിറവേറ്റുന്നതിനായി, ഡിഎൻഎ ചിപ്പുകൾ (ഡിഎൻഎ) പോലെയുള്ള വിവിധ ഹൈ-ത്രൂപുട്ട് കണ്ടെത്തൽ രീതികൾ സ്ഥാപിച്ചിട്ടുണ്ട്.ഡിഎൻഎ ചിപ്പുകൾക്കായി, പ്രത്യേക പേടകങ്ങൾ സമന്വയിപ്പിച്ച് ചെറിയ സിലിക്കൺ ചിപ്പുകളിൽ വളരെ ഉയർന്ന സാന്ദ്രതയിൽ ഘടിപ്പിച്ച് സാമ്പിൾ ഉപയോഗിച്ച് ഹൈബ്രിഡൈസ് ചെയ്യാൻ കഴിയുന്ന ഡിഎൻഎ പ്രോബ് മൈക്രോഅറേ (ഡിഎൻഎ) രൂപപ്പെടുത്തുന്നു.ഹൈബ്രിഡൈസേഷന്റെ സിഗ്നൽ കോൺഫോക്കൽ മൈക്രോസ്കോപ്പ് അല്ലെങ്കിൽ ലേസർ സ്കാനർ ഉപയോഗിച്ച് ചിത്രീകരിക്കാനും കമ്പ്യൂട്ടർ വഴി കൂടുതൽ പ്രോസസ്സ് ചെയ്യാനും വ്യത്യസ്ത ജീനുകളെക്കുറിച്ചുള്ള വലിയ ഡാറ്റ സെറ്റ് നേടാനും കഴിയും.രണ്ട് തരത്തിലുള്ള ഡിഎൻഎ ചിപ്പ് ഉണ്ട്."സിന്തസിസ് ചിപ്പ്" ഇപ്രകാരമാണ്: നിർദ്ദിഷ്ട ഒലിഗോ ന്യൂക്ലിയോടൈഡുകൾ ചിപ്പുകളിൽ നേരിട്ട് സമന്വയിപ്പിക്കപ്പെടുന്നു.ഡിഎൻഎ പൂൾ ചിപ്പാണ് മറ്റൊന്ന്.ക്ലോൺ ചെയ്ത ജീനുകൾ അല്ലെങ്കിൽ പിസിആർ ഉൽപ്പന്നങ്ങൾ സ്ലൈഡിൽ ക്രമാനുഗതമായി പ്രിന്റ് ചെയ്തിരിക്കുന്നു.ഡിഎൻഎ ചിപ്പ് സാങ്കേതികവിദ്യയുടെ പ്രയോജനം ഒരേസമയം ഡിഎൻഎ സീക്വൻസുകളുടെ ഒരു വലിയ അളവിലുള്ള കണ്ടെത്തലാണ്.രോഗാണുക്കൾ കണ്ടെത്തുന്നതിനുള്ള ചിപ്പിന്റെ ഏറ്റവും പുതിയ പതിപ്പിന് ഒരേസമയം 1700-ലധികം മനുഷ്യ വൈറസുകളെ തിരിച്ചറിയാൻ കഴിയും.ഡിഎൻഎ ചിപ്പ് സാങ്കേതികവിദ്യ പരമ്പരാഗത ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് ഹൈബ്രിഡൈസേഷൻ രീതികളുടെ പ്രശ്നങ്ങൾ പരിഹരിച്ചു, വൈറൽ രോഗനിർണയത്തിലും എപ്പിഡെമിയോളജിക്കൽ പഠനത്തിലും വളരെ വിപുലമായ പ്രയോഗങ്ങളുണ്ട്.